在分子生物学实验中，qPCR（实时荧光定量PCR）和WB（Western Blot）堪称黄金搭档：一个检测基因转录水平（mRNA），一个验证蛋白表达量。但当两个实验结果“自相矛盾”时，科研人常常陷入困惑——到底是实验做错了？还是生物学现象另有玄机？今天Connie师兄带你揭开谜底！
原理：基因表达是一个动态过程，转录（mRNA合成）和翻译（蛋白质合成）可能存在时间延迟。例如：
转录早于翻译：qPCR检测到的mRNA水平升高，可能只是基因激活的早期信号（如刺激后6小时达峰），而蛋白合成需要更长时间（如24小时后才显著）。
蛋白质降解滞后：某些蛋白半衰期长达数天（如结构蛋白），即使mRNA已降解（qPCR显示阴性），WB仍能检测到残留蛋白。
示例：细胞处理药物后，qPCR可能在6小时检测到mRNA峰值，而WB在24小时后才显示蛋白质增加。
样本处理：qPCR需要高纯度RNA（要避免RNase/DNA污染），而蛋白质提取需避免变性或聚集（如膜蛋白需强去垢剂）
引物与抗体的“特异性危机”：qPCR常用管家基因（如GAPDH），WB用β-actin，若内参表达波动，导致标准化错误。
救命技巧：务必验证引物效率（标准曲线斜率）和抗体特异性（敲除/敲低模型验证）。
样本保存：若同一批样本分装保存不当（如反复冻融），可能导致RNA降解或蛋白变性。
示例：某课题组用-80℃反复冻存3次的样本做WB，出现多条非特异条带，误判为阳性结果。
灵敏度与特异性：qPCR可检测低至几个拷贝的mRNA，但对RNA质量（如降解）敏感。WB依赖抗体质量，低丰度蛋白或非特异性结合可能导致假阴性/阳性。
三、不可忽视的“内参陷阱”
内参选择不当：用β-actin作WB内参，但在某些处理（如细胞骨架重排）中其表达量会变化，导致标准化错误。
qPCR的“内参飘移”：常用内参基因（如GAPDH、18S rRNA）在某些实验条件下并不稳定，需提前验证稳定性。
救命技巧：使用多内参（如WB同时跑β-actin和GAPDH）或选择组织特异性内参（如心肌中用TBP）。
四、蛋白质稳定性与降解
原理：蛋白质的半衰期差异显著，受以下因素影响：
泛素-蛋白酶体系统：短半衰期蛋白（如p53、细胞周期蛋白）可能快速降解，即使mRNA水平高，WB也难以检测。
溶酶体降解：膜蛋白或错误折叠蛋白可能通过自噬途径降解。
翻译后修饰：磷酸化等修饰可能标记蛋白质进入降解途径。
示例：炎症因子（如IL-6）的mRNA短暂升高，但其蛋白可能被快速分泌或降解，导致WB信号弱。
五、翻译调控的影响
mRNA水平高并不必然导致蛋白质水平升高，翻译过程可能受到多种调控：
翻译抑制：mRNA虽大量表达，但可能被miRNA结合并抑制翻译（如肿瘤中常见），导致蛋白未见增加。
全局翻译抑制：应激条件（如缺氧、热休克）下，细胞通过磷酸化eIF2α等机制暂停翻译。
mRNA稳定性：某些mRNA虽被转录，但因缺乏保护机制（如poly-A尾缩短）被快速降解，无法有效翻译。
翻译效率的“变量因素”：密码子偏好性、RNA结合蛋白调控等机制，可能导致相同mRNA产生不同蛋白量。
示例：肿瘤细胞中某些致癌基因的mRNA可能因miRNA抑制而无法翻译为蛋白。
六、翻译后修饰与蛋白活性
原理：WB检测的是蛋白质的“存在”，而非“功能状态”：
亚细胞定位的“障眼法”：蛋白可能表达后快速分泌（如细胞因子）或进入特定细胞器（如线粒体），若未裂解完全则WB检测不到，导致总蛋白检测（WB）与mRNA（胞质内）不匹配。
翻译后修饰的“变形记”：如磷酸化、糖基化可能改变抗体识别表位（需特定修饰抗体），泛素化等修饰会改变分子量，可能导致WB条带位置偏移而被误判为阴性。
示例：信号通路蛋白（如ERK）的激活依赖磷酸化，总ERK的WB结果可能与qPCR的mRNA水平无关。
七、引物与抗体的“特异性危机”
qPCR引物设计不当（如跨外显子连接处失败）可能导致假阴性。
WB抗体交叉反应（识别相似蛋白）则会产生假阳性条带。
救命技巧：务必验证引物效率（标准曲线斜率）和抗体特异性（敲除/敲低模型验证）。
表1. 常见不一致场景
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qPCR结果 |
WB结果 |
潜在原因 |
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mRNA升高 |
蛋白未变 |
翻译抑制、蛋白半衰期长 |
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mRNA未变 |
蛋白升高 |
翻译效率提升、蛋白降解减少 |
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mRNA升高 |
蛋白降低 |
蛋白加速降解（如泛素化） |
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mRNA与蛋白均无变化 |
功能变化 |
翻译后修饰或蛋白活性改变 |
qPCR与WB结果不一致时，不必急于否定数据。逐步排查实验误差，结合多组学（如RNA-seq、蛋白质组学）或辅助其他实验手段，往往能揭示更深刻的调控机制。记住：好的科研问题，常常藏在“矛盾”的裂缝中！
