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双荧光素酶报告基因系统——基因分析便捷工具

发表时间:2022-11-22

近年来,基于基因工程原理发展起来的报告基因技术逐渐成为最具有发展潜力基因分析工具之一。

报告基因

报告基因是一类编码可供检测的酶与蛋白的基因,是现代分子生物学研究领域中用于分析基因转录和调控的一种便捷工具,可用来分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子间的相互作用关系。

启动子是真核基因转录起始位点上游一段长度不等的特异性序列,该片段有多种调节因子的结合位点,能顺式调控基因的转录,因此可以通过检测启动子的激活程度间接定量蛋白(如Ⅰ型干扰素)的表达量。

作为报告基因的条件:

编码产物的活性不受宿主细胞的干预;

编码产物在宿主细胞本身不存在,易区分;

编码产物的活性测定必须快速、简便、灵敏度高、重复性好。

常用的报告基因:

氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、β-gal、荧光素酶基因(Luc)

报告基因的应用:

探讨启动子作用,细胞信号转导,基因转录调节,作为分子标记,生物大分子间的相互作用,RNA干扰研究,影像技术,药物筛选等

在如今发展起来的众多报告基因中,荧光素酶报告基因以检测快速、灵敏度高、线性范围广,且在大多数哺乳动物细胞无内源性表达等诸多优点而备受青睐。

双荧光素酶报告基因系统

双荧光素酶报告基因检测系统采用萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)组成双荧光素酶报告基因实验系统(Dual-Luciferase Reporter Assay),可以较好地体现检测结果的精确性。

实验中萤火虫荧光素酶与基因表达的特定实验条件相关,海肾荧光素酶用来做转染的内参,以校正不同样品之间转染的转染效率。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶不需要翻译后修饰即具有生物活性,一旦翻译完成即具有报告基因的功能。通过加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应过程中会发出生物荧光,然后可以通过荧光测定仪测定反应过程中释放的生物荧光。

与传统的共报告基因(如 CAT,β-Gal,GUS)相比,双荧光素酶报告基因系统更加灵敏,有望把可能削弱实验准确性的内在因素(如培养细胞的数目和健康状况的差别、细胞转染和裂解效率的差别等)的变化降到最小,而且报告基因的检测极为快速(30s内完成测试)、简便。

双荧光素酶报告基因检测设计图及原理图示


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