被磷酸化Western Blot虐哭的进！磷酸化WB救命指南让你条带稳又强！

条带弱、背景高、结果飘......做磷酸化蛋白Western Blot（WB）的痛谁懂！！！磷酸化蛋白WB之所以成为实验室“噩梦”，本质是低丰度+高动态+易降解等原因，任何一步操作的偏差都会导致信号丢失或非特异性信号放大。今天Dr. Connie会对磷酸化蛋白WB实验的痛点进行分析，并分享磷酸化蛋白WB实验改善建议。

磷酸化蛋白WB痛点及解决方案

样本制备

1、  占比小：磷酸化蛋白通常仅占总蛋白总量的1%-10%，需检测的信号接近WB检测下限。

2、  动态范围窄：激酶/磷酸酶活性变化导致磷酸化水平在几分钟内波动（如EGF刺激后EGFR磷酸化5分钟达到峰值，30分钟降至基线），易错过真实信号。

3、  磷酸酶持续作用：细胞裂解后会释放大量内源性蛋白磷酸酶，短时间内可催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致磷酸化水平衰减。

4、  温度敏感：室温下磷酸化蛋白半衰期仅数分钟（如MAPK磷酸化在25℃下10分钟降解90%）。

综上所述，磷酸化蛋白WB成功的关键首先在于蛋白样品的质量！所以部分磷酸化蛋白WB实验失败，可能是因为样品制备出了问题，因此该环节尤其重要！

因此，蛋白提取过程中全程冰浴，保证低温操作；蛋白裂解液按比例加入磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解或去磷酸化；为保证磷酸化活性，尽量使用新鲜蛋白样本，液氮速冻，-80℃分装保存，避免反复冻融；电泳时保证足够的蛋白上样量。

抗体选择

1、  查阅高分或相关文献，确定目的蛋白磷酸化位点，选用已验证过的磷酸化抗体，使用高效的磷酸化抗体，能提高信号灵敏度（不同批次抗体可能灵敏度差异大，建议同一类型实验使用同一批次抗体）。

2、  总蛋白表达量可作为另一种形式的内参蛋白，可区分磷酸化蛋白表达量是和总蛋白表达量动态一致，还是未改变总蛋白表达量，只是磷酸化水平有变。因此除了设置常用的GAPDH/β-actin内参蛋白外，建议同步检测总蛋白表达量（例如你要检测Akt磷酸化水平，也要同步检测Akt蛋白表达水平，只有磷酸化蛋白/总蛋白的比值变化，才能说明磷酸化水平发生相对变化）。

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电泳及转膜

1、  根据目的蛋白大小选择合适胶浓度，电泳全程冰浴，避免温度过高导致磷酸化降解。

2、  磷酸化蛋白WB容易出现非特异性条带，可选用合适的蛋白Marker确定目的蛋白大小，避免乌龙结果导致“空欢喜”。

3、  使用新鲜配置的转膜液，可提高转膜效率。

4、  PVDF膜比NC膜更有效的捕捉磷酸化蛋白，更适合磷酸化蛋白的转移。

5、  磷酸化蛋白可能出现转膜效率低等情况，尤其小分子的磷酸化蛋白容易过度转膜，可根据经验适当缩短转膜时间或者降低转膜电压。

封闭及抗体孵育

1、  封闭：封闭液建议使用5% BSA，效果可能优于5%脱脂奶粉（部分同学反映使用脱脂奶粉会导致背景很高，条带弥散等异常情况，可能是由于部分脱脂奶粉中含有磷蛋白——酪蛋白，导致磷酸化蛋白降解引起高背景。也有同学反馈，实验室做磷酸化抗体一直都是用5%脱脂奶粉进行封闭，可根据具体情况进行优化），室温封闭1h即可，封闭时间不宜过长。

2、  抗体孵育：根据抗体厂商说明书中的Protocol对抗体进行稀释，或根据文献中抗体的稀释比例及方法对抗体进行稀释，一抗建议4℃过夜孵育，可让抗体充分结合，以便获取最佳条带，抗体孵育时间及浓度根据实际实验结果进行优化。

磷酸化蛋白WB实验的每个环节都可能影响最终结果，因此要特别注意样品的磷酸化状态，也要根据实际情况不断优化实验条件，确保最终结果的准确性和可重复性！

AntibodySystem可以为客户提供一系列具有高特异性、高灵敏度特点的磷酸化抗体，满足WB、IHC等应用。

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