如果你：
?第一次听说免疫荧光
?看别人发的IF图只会“哇好好看”
?一想到要自己做就开始紧张
那这篇，就是为你写的。
不讲玄学、不默认你“什么都懂”，从0开始，带你完整走一遍真正能做成的免疫荧光实验。
一、先别急着做实验：免疫荧光到底在干嘛？
免疫荧光=用会发光的抗体，告诉你“某个蛋白在细胞的哪里”
打个比方：
显微镜一照：
灯亮在哪里，蛋白就在哪里。
它能回答什么问题？
这是WB做不到的，WB只能告诉你“有或没有”。
二、实验前准备：你需要哪些“装备”？
原则：你不需要一次性全懂，只要知道“这是干嘛的”
1. 细胞相关（舞台&主角）
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名称 |
是什么 |
小白重点 |
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细胞爬片 |
一块小玻璃 |
细胞要“粘”在它上面 |
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24孔板 |
装爬片的“盒子” |
新手最友好 |
|
你的细胞 |
实验主角 |
状态不好 =必翻车 |
2. 三大关键试剂（一定要理解）
①固定液（4% PFA）
类比：给细胞拍一张永不模糊的照片
②透化液（Triton X-100）
核蛋白必须透化！
③封闭液（BSA/血清）
类比：给细胞刷一层“防粘涂层”
3. 抗体（灵魂所在）
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名称 |
一句话理解 |
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一抗 |
专门认目标蛋白 |
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二抗 |
带荧光、负责“发光” |
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DAPI |
蓝色，专门染细胞核 |
第三章：完整实验流程（按天走，不会乱）
Day 1：细胞铺板——让细胞在爬片上安家（让细胞“住好”，这是成败第一关）
目标：让细胞均匀、稀疏地长在爬片上。
步骤：
准备爬片：用镊子夹取一片干净的细胞爬片，小心放入24孔板的一个孔中央。轻压一下确保贴底。
小贴士：可以提前将爬片用酒精浸泡消毒，再紫外线照超净台晾干。
消化细胞：按你平时传代的方法，消化、离心收集你要实验的细胞。
细胞计数与稀释：用细胞计数板计数，然后用完全培养基将细胞浓度调整到每毫升1-5万个细胞左右。密度一定要低！（你问为什么？细胞铺得稀疏，染色后结构才清晰，方便观察定位。）
接种细胞：在放好爬片的孔中，轻轻加入1mL稀释好的细胞悬液。动作一定要轻柔缓慢，沿着孔壁加，避免把爬片冲跑。
混匀与培养：加好后，用手轻轻十字晃动几下孔板，让细胞分布均匀。然后，平稳地将孔板放入37℃、5% CO2的培养箱中，培养过夜（约16-24小时）。
核心原则（记住这3条）
?细胞要稀
?分布要均匀
?太密=看不清结构
这一步做好了，实验已经成功40%！
Day 2：固定→透化→封闭→一抗（今天是“最重要的一天”）
目标：把细胞“固定”住，做好染色准备，并让一抗与目标蛋白结合。
步骤：
取出与清洗：从培养箱拿出孔板，用移液器小心吸弃孔内的培养基。
PBS清洗：每孔加入1mL预冷的PBS，轻轻晃动几下，然后吸弃。重复此步骤3次。目的是洗去残留血清和死细胞。
警告：全程动作轻柔！用力过猛会把细胞从爬片上冲下来！
固定细胞：每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室温放置20分钟。这是为了让细胞形态和内部蛋白位置永久“定格”。
小贴士：固定后，细胞会变脆弱，后续操作要更小心。
PBS再清洗：固定结束后，吸弃固定液，用PBS洗3次，每次1mL。
透化（关键步骤！）：每孔加入1mL0.1%-0.5% Triton X-100。放入4℃冰箱10分钟。这步是在细胞膜上打孔，让抗体能进入细胞内部。
小贴士：核蛋白必须透化！膜蛋白如果靶点在膜外，可省略此步或缩短时间。
PBS大量清洗：吸弃透化液，用PBS洗5次，每次1mL，彻底去除Triton。
封闭：每孔加入1mL 3%-5% BSA封闭液，室温放置30分钟。BSA会填满细胞上非特异性的位点，防止一抗乱粘。
孵育一抗：直接吸弃封闭液（不用洗）。按抗体说明书推荐的稀释比例（比如1:200），用BSA溶液稀释好你的一抗。用移液器吸取200-300μL稀释后的一抗，滴加到孔中央，确保液体完全覆盖爬片。
小心将孔板放入4℃冰箱，孵育过夜（>16小时）。低温长时间孵育，结合效果更好更特异。
到这里，你已经完成了真正的免疫荧光核心操作。
Day 3：二抗→DAPI→封片
目标：用荧光二抗“点亮”一抗，标记细胞核，最后把爬片封存到载玻片上。
警告：从今天开始，全程避光！避免荧光淬灭！
步骤：
回收一抗：从冰箱取出孔板，用移液器将孔内的一抗液体吸回EP管（一般可回收再利用2-3次）。
PBS清洗：每孔加入1mL PBS，晃动洗涤，吸弃。重复4次，每次5分钟，充分洗去未结合的一抗。
孵育荧光二抗：用BSA溶液按说明书稀释你的荧光二抗（如1:500）。
避光条件下，每孔加入200-300μL稀释好的二抗，确保覆盖爬片。
室温，避光，孵育1小时。
荧光选择：常用绿色荧光（FITC/488nm）或红色荧光（TRITC/568nm）。DAPI是蓝色。
PBS清洗：避光条件下，吸弃二抗，用PBS洗3次，每次5分钟。
DAPI染核：用PBS稀释DAPI（通常1:1000），每孔加入200-300μL，室温避光孵育3-5分钟（时间勿长）。
PBS终洗：避光条件下，快速吸弃DAPI，用PBS洗2次，每次5分钟，洗去多余染料。
封片（精细活！）：
取一张干净的载玻片，滴加1小滴（约10-20μL）抗荧光淬灭封片剂在中央。
用尖头镊子小心地从孔中夹出爬片，用滤纸轻轻吸干爬片边缘和背面的液体（注意：有细胞的那一面是朝上的！）。
将爬片有细胞的那一面向下，轻轻盖在封片剂液滴上，确保细胞面与封片剂充分接触且没有气泡。
将做好的玻片放在避光、干燥的盒子里，室温下晾干过夜（或至少4小时），使封片剂凝固。
Day 4：荧光显微镜观察——见证奇迹的时刻！
目标：上机拍照，获得你的第一张免疫荧光美图！
步骤：
选择激发光：
想看DAPI（细胞核），选择紫外光或405nm激光。
想看绿色荧光（如FITC），选择蓝光（488nm）。
想看红色荧光（如TRITC），选择绿光（543nm或561nm）。
观察与拍照：
先在白光下找到细胞位置。
切换到荧光通道，先看DAPI通道找到细胞核。
再切换到目标蛋白的荧光通道，观察荧光信号的位置（与细胞核重叠？在细胞质？在细胞膜？）。
调节曝光时间，使信号清晰且不过曝。同一组实验的拍照参数要固定！
最后，可以拍下各个通道的单张图，以及合并（Merge）图。
保存与分析：保存原始图像数据。可以用Image J等软件进行后续的荧光强度分析、共定位分析等。
恭喜你！大功告成！
现在，你已经完成了人生中第一次免疫荧光实验。如果你能完整做到这里，你就已经不是免疫荧光小白了。
看着显微镜下那些被点亮的细胞，是不是成就感满满？
建议：
l 第一次一定找师兄师姐陪跑
l 多拍对照
l 失败≠你不行，往往只是参数没调好
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货号 |
产品名称 |
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RGK23942 |
Anti-DNA Antibody(F2-3) |
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RGK24020 |
Anti-dsDNA Antibody(3E10#) |
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RGK24303 |
Anti-6,4DNA/6-4PPs Antibody (64M-2) |
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FHK18510 |
Anti-Human CD8 Antibody(G10-1) |
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RGK08501 |
Anti-Flag Tag (DYKDDDDK) Antibody (M2) |
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RGK25601 |
Anti-SSEA4 Antibody (MC813-70) |
|
RGK26002 |
Anti-polyglutamine/polyQ Antibody (1C2) |
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FHD10840 |
Anti-Human CD19 Antibody (FMC63) |
|
RHC59303 |
Anti-K63-linked Polyubiquitin Antibody (SAA0330) |
|
RVV03302 |
Anti-Influenza A virus NP/Nucleoprotein Antibody (SAA0411) |
|
RGK11203 |
Anti-Ganglioside GM3/NeuGcGM3 Antibody (SAA0555) |
|
RGK32701 |
Anti-GXM/glucuronoxylomannan Antibody (SAA0561) |
