蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）经常被大家亲切地称为“玄学实验”，WB实验步骤较多，因此任何步骤都可能出现变化和错误，从而降低该技术的可靠性和重复性。
WB的可重复性一直是实验技术人员关注的焦点。通过对实验结果的科学分析，进而优化改进实验方案，我们可以避免大多数问题。今天就介绍一下WB常见问题及其产生原因，并提供改进方法，希望能对大家的研究有所帮助。
示例：
①一抗和二抗种属不匹配（完全没有条带）。
一般来说，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于WB来说，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，亲缘关系越远越好，不宜同源，从而避免与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。例如：检测小鼠样本蛋白，则不应该选择小鼠或者大鼠源的一抗，最好选择兔源或者其它物种源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔或山羊IgG；当然也有可能是抗体不新鲜或者反复多次使用导致有效浓度降低。
解决方法：
订购试剂时选择一抗与组织种属相匹配的抗体；可以通过设置对照验证抗体的有效性；选择生产日较近的抗体，分装保存避免反复冻融。
②没有足够的一抗或者二抗结合目的蛋白（条带微弱或没有条带）。
通常来说，抗体与抗原之间的特异性结合是一个分子运动的随机过程，是一个概率问题，如果概率变大时，与抗原结合的抗体数量就会增加，可检测到的信号也就随之增强。在同等体积的体系中，膜上目标蛋白的量是一定的，如果想要增加抗体分子与膜蛋白分子接触碰撞的概率，除了提高温度之外，可以增加物质的量，即增加抗体的浓度，抗体和抗原之间的有效碰撞会增加，当然，适当延长反应时间也可以。
解决方法：
适当增加一抗和二抗的浓度和孵育时间，并减少孵育后洗涤时间和频率。
③无靶蛋白或者靶蛋白含量较低（条带微弱或没有条带）。
靶蛋白从细胞或者组织中提取出来，在电场力的作用下，按照分子量大小分离，转移到膜上，最后被抗体特异性识别，在抗体识别靶蛋白的过程中，假设抗体是足量的，而靶蛋白含量较低，可能也检测不到或者信号很微弱。在此过程中，可能很多操作会导致蛋白含量下降，比如提蛋白的时候所加蛋白酶抑制剂不足、没有选择合适的裂解液、上样量不足、电泳浓缩不够、小分子蛋白电泳跑出界、转膜时间过短等。
解决方法：
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，而样本没有则可能是样本中不含靶蛋白或含量太低；查阅相关文献，如目标蛋白本身表达较低可以增加上样量至30-50μg或者设置上样量梯度，从而选出最佳上样量；提蛋白时根据目标蛋白选择合适蛋白酶抑制剂和裂解液（如核蛋白、膜蛋白、全蛋白裂解液）；小分子蛋白电泳时应选择高浓度分离胶并减少电泳时间；增加转膜时间确保足量目标蛋白转移至固相载体膜上，PVDF膜可结合更多的蛋白，但必须甲醇浸泡活化，丽春红染色检验转膜效果。
④过度封闭（条带微弱或没有条带）。
封闭液中的蛋白不止填补膜上的空隙，而且还会和膜上已有的蛋白，包括杂蛋白和目标蛋白产生竞争性的洗脱作用，将杂蛋白从膜上洗脱下来，这就是为什么延长封闭时间会减少背景的原因，同时这种竞争性洗脱也会把目标蛋白产生作用，所以封闭时间过长会减弱目标蛋白条带信号。
解决方法：
减少封闭时间，选择合适的封闭液（脱脂牛奶、BSA等）。
⑤曝光时间过短（条带微弱或没有条带）。
解决方法：
增加曝光时间。
示例：
①未进行特异性封闭或者封闭不充分
封闭是抗体孵育前必不可少的步骤，选择合适的封闭液封闭适当的时间能够大幅度减少非特异性背景，一般选择5%脱脂牛奶或者BSA，一般常温摇床封闭2h。
解决方法：
根据显影背景程度适当延长封闭时间，选择合适的封闭剂。
②膜被污染或者干燥
手指皮肤表面含有蛋白质和油脂，实验过程中避免不带手套接触膜，同时膜全程不可干燥。
解决方法：
实验全程戴手套用镊子操作，膜始终保持湿润，避免直接暴露在空气中较长时间。
③洗膜不充分
抗体除了和抗原特异性结合之外，也会与其他蛋白质或者膜非特异性结合，尽管这种结合力很微弱，但是仍然会被检测到。
解决方法：
洗涤液中添加吐温-20，增加洗涤次数，通常3次，每次10min；另外如果在显影过程中发现背景较深，也可以增加洗涤时间和次数重新显影。
④抗体浓度过高，孵育时间过长。
抗体的本质也是一种蛋白质，如同一体系中，抗体物质的量较大，反应时间过久，温度过高，除了特异性结合抗原之外，与其他蛋白质非特异性结合以及竞争性洗脱膜蛋白质的概率会大大增加。
解决方法：
根据实验结果和上样量，降低抗体尤其是二抗浓度，减少孵育时间。
⑤膜不合适。
PVDF膜泡过甲醇之后，膜上的正电基团被活化，与带负电的蛋白质结合，这种静电作用力比NC膜与蛋白的结合更紧密。因此PVDF膜能结合更多的蛋白质，杂蛋白被洗涤的难度也会增加，因此背景可能会随之增加。
解决方法：
PVDF膜更换成NC膜。
三、其他问题
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问题及示例 |
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多条非特异性条带或者条带位置不对 |
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原因 |
解决方法 |
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细胞传代次数过多，促使其蛋白表达模式发生变化 |
使用原始或者传代次数少的细胞株 |
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体内蛋白具有多种修饰方式： 甲基化、乙酰化、糖基化 |
使用去修饰的试剂使其恢复正确的大小 |
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蛋白样本降解 |
使用新鲜制备的样本； 使用蛋白酶抑制剂 |
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一抗浓度过高 |
降低抗体浓度 |
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二抗浓度过高，产生非特异性结合 |
降低抗体浓度，增加二抗对照； 选择特异性更强的二抗 |
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抗体未纯化 |
使用单克隆或者亲和纯化的抗体 |
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蛋白存在二聚体或者多聚体 |
上样前，100℃煮样品5-10min，增加变性解聚 |
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问题及示例 |
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条带不完全均一 |
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原因 |
解决方法 |
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凝胶聚合不均匀 |
制胶充分混匀，缓慢灌入 |
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抗体孵育不均匀 |
充分稀释抗体，摇床孵育 |
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问题及示例 |
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条带拖尾 |
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原因 |
解决方法 |
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上样量太多，一抗浓度太高 |
降低上样量和一抗浓度 |
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样本中含有组织碎片 |
上样前煮沸并离心 |
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浓缩效果较差 |
加长浓缩胶长度 |
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问题及示例 |
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背景有白圈 或者黑色斑点 |
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原因 |
解决方法 |
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转膜是有气泡或者抗体孵育不均匀 |
转膜时每一步去除气泡，抗体稀释充分混匀，抗体孵育时摇床保持摇动 |
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脱脂牛奶未完全溶解 |
充分溶解脱脂奶粉并过滤，封闭完之后清洗几遍再孵育抗体 |
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问题 |
原因 |
解决方法 |
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深背景且出现白色空心条带
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二抗浓度过高，导致底物加上即被完全消耗 |
稀释抗体浓度 |
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出现微笑条带
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电压过高，电泳系统温度过高 |
降低电压，电泳过程保持冰浴 |
