自1975年第一支单克隆抗体诞生以来，越来越多的抗体（如嵌合抗体，人源化抗体，以及全人源抗体）被应用于各种包括癌症、自身免疫、代谢和传染病的诊断和治疗，显示出不断扩大的应用前景。然而，在大多数情况下，较小尺寸的抗体不稳定，导致多聚体（特别是单链可变片段，scFv）较低的亲和力结合，以及大规模生产的挑战。
The various antibody formats: (A) mAb (monoclonal antibody); (B) Fab (fragment antigen binding); (C) HcAb (camel heavy-chain antibody); (D) VHH or Nb (nanobody). Adapted from Yang X, Xie S, Yang X, et al. Opportunities and Challenges for Antibodies against Intracellular Antigens. Theranostics.
骆驼和鲨鱼体内天然存在一种缺乏轻链的独特抗体，称为可变重链域，又称纳米抗体（nanobody，VHH）。该抗体仅包含一个可变区，体积小（约15kDa）、亲和力高、特异性强、稳定性高、组织穿透性强、高效表达、低毒性和低免疫原性等特点，在生化机制、结构生物学、肿瘤等疾病的诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
Comparison between traditional IgG antibody and camelid heavy-chain antibody. (A) Traditional IgG antibody has two identical heavy chains, consisting of VH, CH1, CH2, and CH3 domains, and two identical light chains, consisting of VL and CL domains. (B) Camelid heavy-chain antibody contains one VHH and two constant domains (CH2 and CH3). A Nb is the VHH domain of heavy-chain antibody obtained by recombinant gene technology. (C) The difference in amino acid sequence of VH and VHH. The average length of the CDR1 and CDR3 is better in the VHH domain than in the VH domain. The dotted line indicates the additional disulfide bond between CDR1 and CDR3 of the VHH domain. The Numbering of the international ImMunoGeneTics-IMGT information system is pointed out.
纳米抗体和传统抗体的优劣对比
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性能 |
传统抗体 |
纳米抗体 |
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抗体表达 |
在哺乳表达系统中表达，周期长、成本高 |
既可在哺乳系统中表达，又可在大肠杆菌表达系统中表达，表达的抗体具有高水溶性、易复性 |
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抗体稳定性 |
易失活，高温或极度PH下失效或分解 |
高稳定性，高耐性，90℃处理后依然保持较高的活性 |
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免疫原性 |
较高 |
较低 |
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组织穿透力 |
较低 |
较高，可穿透血脑屏障 |
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半衰期 |
较长 |
较短，血清清除速度快 |
纳米抗体的制备
基于完备的抗体开发技术平台以及高效的重组蛋白表达系统纳米抗体的获得主要通过免疫羊驼，由羊驼体内自身抗体成熟阶段来得到抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到最适合的抗体序列。纳米抗体制备的整个流程主要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建、抗体筛选、抗体表达及功能验证四个阶段。
羊驼免疫
每只羊驼可以同时免疫1-5个抗原，每次免疫总的抗原量保持在1-2mg之间，体积在2mL以下，将抗原和佐剂1：1乳化使其形成均匀混合物，4°保存，共进行四轮免疫。
噬菌体文库构建
抽提羊驼淋巴细胞中RNA并反转成cDNA文库，利用特殊设计的引物在cDNA文库中再次进行PCR扩增，得到特异的基因片段。随后将特异的基因片段拼接重组在噬菌体载体上，并转染大肠杆菌，最终完成纳米抗体基因文库的构建。
抗体筛选
将靶点抗原或者带有抗原的物质直接/间接的固定在固体载体上，随后加入噬菌体文库和抗原相互作用。作用一段时间后阳性噬菌体会和抗原结合，用洗涤液洗涤固体载体表面，可以将未结合或非特异结合的噬菌体洗去。随后用强酸或者强碱破坏固体载体上抗原和阳性噬菌体的结合，从而得到阳性噬菌体溶液。一般重复进行2-3轮的筛选即可获得符合开发要求的纳米抗体克隆。
抗体表达及功能验证
通过噬菌体文库淘选出的纳米抗体克隆菌株进行纳米抗体片段DNA测序后即可进行表达纯化及验证。纳米抗体可在大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞系里进行表达，因其仅含100多个氨基酸残基，为验证其是否与抗原结合，可构建质粒在大肠杆菌中或酵母菌株中进行快速表达及纯化。
